Плазмида

Исследование роли микрогравитации на частоту переноса и мобилизации плазмид у бактерий.

В условиях космического полета чувствительность автомикрофлоры космонавтов к антибиотикам претерпевает существенные изменения. Это выражается в формировании множественно устойчивых штаммов условно патогенных микроорганизмов. Распространяясь среди членов экипажа, эти микроорганизмы накапливают детерминанты резистентности к антибиотикам при взаимодействии с представителями нормальной микрофлоры, в составе которой присутствуют те или иные детерминанты антибиотикорезистентности. Это обстоятельство является потенциально опасным в силу того, что образующиеся полирезистентные штаммы условно патогенных микроорганизмов являются своеобразным депо для плазмид множественной лекарственной устойчивости и употребление антибиотиков может вызвать их селективный рост.

Предполагается, что основной механизм формирования полирезистентных штаммов связан с рекомбинациями плазмид, которые определяются как частотой передачи конъюгативных плазмид, так и возможностью мобилизации конъюгативными плазмидами неконъюгативных. Известно, что преимущественным путем распространения плазмид в природе является конъюгация. Предполагается, что фактор микрогравитации является определяющим в возможном изменении частоты переноса плазмид. Поэтому представляется целесообразным изучение процесса переноса плазмид и их мобилизации в условиях космического полета. Впервые предлагается сочетанный эксперимент, предусматривающий адаптацию культур к длительному космическому полету и бактериальную коньюгацию в космосе.

Эксперимент «Плазмида» спланирован таким образом, чтобы его выполнение осуществлялось при активном участии учащихся школы ГОУ «Интеллектуал» в качестве их исследовательского проекта. Работы были начаты в лаборатории вирусов микроорганизмов ИНМИ РАН им. С.Н. Виноградского, а затем перенесены в ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

На основании анализа литературы и исходя из имеющейся коллекции фагов и плазмид, в качестве трансдуцирующего фага был выбран колифаг RB43. В качестве хозяина использовали штамм E.coli DH5alpha. В качестве переносимой плазмиды первоначально использовали высококопиный вектор pUC21, однако, в последствии было принято решение заменить его на pUK21, имеющий тот же репликон, но содержащий маркер устойчивости к канамицину вместо ампициллина. При использовании канамицина в качестве селектирующего агента дополнительно достигается предотвращение развития фага в инфицированных чувствительных клетках, что уменьшает нежелательное воздействие нетрансдуцирующих жизнеспособных фаговых частиц на трансдуктантов.

В результате подобрана методика трансдукции при которой наблюдаемая частота этого явления (отношение числа КОЕ трансдуктантов к числу БОЕ фага, выращенного на культуре, содержащей плазмиду) составляет около 10^-5, что надёжно детектируется стандартными методами посева.

Штаммы доноров и рецепиентов плазмид доставляются на станцию на поверхности агазированной питательной среды при температуре 4-8°С. На МКС космонавт с помощью шприца впрыскивает питательный биораствор на поверхность агазированной среды, отсасывает опять с помощью шприца суспензию и смешивает суспензию доноров и рецепиентов. Смешанные суспензии в загерметезированном шприце экспонируются 24 часа при температуре 37°С. После экспозиции шприцы с суспензией переносятся в камеру с температурой 4°С. Происходит холодовая фиксация материала до возвращения его на Землю.

Рекомендован РАН для реализации в составе РС МКС на 2011-2020 годы.

Объём и сроки реализации - 10 сеансов КЭ (длительность одного сеанса - до 21 суток).

Впервые предложен сочетанный эксперимент, предусматривающий адаптацию культур к длительному космическому полету и бактериальную конъюгацию в космосе.

При проведении эксперимента должна использоваться аппаратура «Плазмида», состоящая из следующих, компонентов:

- укладка «Плазмида» с гибридизационными камерами. Габаритные размеры - O115x110. Масса - 2,4 кг;

- «Рекомб-2», в состав которого входят:

а) блок электропривода (БЭП -К). Габаритные размеры 195x195x150, масса 4 кг;

б) блок управления приводом (БУП -К). Габаритные размеры 100x150x80, масса 2 кг;

в) комплект соединительных кабелей;

г) блок ручного привода (БРП - К). Габаритные размеры 195x19 5x150, масса 4 кг;

д) ГК - 4 шт. Габаритные размеры одной ГК O44x96 мм.

Кроме этого для обеспечения эксперимента используется типовое оборудование биотехнологических экспериментов:

- ТБУ для проведения процесса гибридизации при температуре плюс 37±1°С, а также для хранения укладки «Плазмида» до начала сеанса эксперимента и после окончания сеанса эксперимента при температуре плюс 4±1°С;

- ТВК, предназначенный для доставки укладки «Плазмида» на PC МKC и возвращения ее на Землю;

- термостат-холодильник "Криогем-03М", термостат-холодильник "Криогем-03" массой 21,3 кг.

Получение новых данных о влиянии гравитации на процессы распространения внехромосомных факторов наследственности и стабильности плазмидного генома в трансконъюгантах.

Проведение по возвращении на Землю фенотипических свойств полученных культур, наземной селекции стабильных гибридов и изучение свойств полученных вариантов штаммов.

В результате эксперимента будет представлена модель влияния гравитации на процессы конъюгации.

Следует ожидать, что полученные результаты будут иметь большое теоретическое значение для всех областей гравитационной биологии, в том числе для фундаментальных исследований в области физиологии и медицины.

В ходе предполетной подготовки получены и и простерилизованы фаговые лизаты, осуществлено титрование бактериофага двуслойным методом, осуществлено титрование жизнеспособных клеток, выделена плазмидная ДНК, отработана циклограмма эксперимента.

Результаты эксперимента свидетельствуют о существенном возрастании частоты передачи плазмид в условии космического полета для популяции доноров. Практически все донорские клетки вступили в конъюгацию с реципиентом в космическом полете, в отличии от контроля, где конъюгировало лишь до 10 % донорских клеток. Плазмиды в трансконъюгантах, образованных в опыте и контроле были стабильны.

Готовятся к опубликованию по мере накопления статистического материала, наземной его обработки и анализа.