Астровакцина

• Изучение влияния условий космического полета на сохранность и продуктивные свойства рекомбинантного штамма E.coli HB101/pVHB62 - продуцента генно-инженерного белка V-антигена с последующим культивированием в наземных условиях и наработкой высокоочищенного белка; ­

• оценка его пригодности для научных и практических задач, связанных с направленным созданием новых лекарственных препаратов и вакцин против иерсиниозов (чумы) и других инфекционных заболеваний человека и животных; ­

• проверка надежности пенала «Биоэкология», обеспечивающего сохранность бактериальных культур в космических условиях.

В ряде исследований было продемонстрировано, что под действием экспозиции в течение нескольких дней в условиях микрогравитации наблюдается увеличение числа живых клеток в культурах рекомбинантных штаммов E.coli. В активной фазе роста наблюдалось усиление роста культур, в период старения культуры повышалась выживаемость клеток. Это можно объяснить усилением спонтанного синтеза рекомбинантных белков. Существует предположение, что этот эффект может быть вызван увеличением амплификации плазмид в период активного роста культуры в условиях микрогравитации. Эти данные позволяют предположить, что для любого рекомбинантного штамма бактерий могут быть подобраны условия, при которых экспозиция в условиях орбитального полета приведет к увеличению числа копий плазмиды, кодирующей синтез рекомбинантного белка, по крайней мере, в части клеток популяции. Это означает, что инкубацию в условиях орбитального полета с последующей селекцией на Земле можно использовать в качестве метода получения линий штаммов — продуцентов с повышенным числом копий плазмид, контролирующих синтез целевых продуктов.

В ОАО "Институт инженерной иммунологии" клонировали и секвенировали капсулярный f1 оперон Yersinia pestis и обнаружили, что экспрессия капсулярной субъединицы CaflA Y.pestis, имеющей гомологию с семейством интерлейкинов-1 человека (hiL-1), служит медиатором к продукту Сaf1M гена, имеющего гомологию с суперсемейством иммуноглобулин подобных молекулярных шаперонов, включающих хорошо известный белок PapD уропатогенной E.coli.

В качестве объектов исследования использовали клетки Е.coli – продуцента генно-инженерного белка-антигена Cafl Y.pestis. Сеанс эксперимента проводился в период смены экипажей МКС.

Эксперимент рассчитан на длительное (в течение нескольких суток) воздействие факторов орбитального космического полета на растущие культуры микроорганизмов. В космическом эксперименте рабочие культуры находились в четырех пробирках на скошенной агаризованной питательной среде (косячки) в летном пенале укладки «Биоэкология» КЭ «Астровакцина». В качестве контроля использовали рабочие культуры, находящиеся в наземных условиях в холодильнике при +4°С в четырех пробирках на скошенной агаризованной питательной среде.

Культивирование Е.coli -продуцента генно-инженерного белка-антигена Cafl Y.pestis в условиях космического полета отечественными и зарубежными исследователями ранее не выполнялось.

Для проведения космического эксперимента использовалась аппаратура (укладка) «Биоэкология. Укладка «Биоэкология» (рис. 1) включает в себя 4 пенала (рис. 2), предназначенных для транспортировки, экспонирования и хранения биообъектов. Каждый из четырех пеналов «Биоэкология» представляется собой контейнер, размещенный в чехле. В каждом пенале размещается: ­

- двенадцать пробирок, в каждой пробирке находится по 1 ампуле с лиофильно высушенным материалом; ­

- 4 тубы, в каждой тубе находится 1 пробирка с биообъектами на питательной среде. ­

- регистратор температуры (РТ).

Пробирки и тубы герметичны.

Рисунок 1. Место установки укладки «Биоэкология» в КЭ «Астровакцина» в СМ РС МКС.

Рисунок 2. Пенал «Биоэкология».

Понимание молекулярных механизмов перехвата ключевого макрофатального сигнала при воспалении и адаптивном иммунном ответе к Y.pestis играет важную роль для разъяснения патогенеза чумы и бактериальных инфекций в целом и чрезвычайно важно для создания эффективных вакцин и антимикробных средств. Культивирование в условиях космоса E.coli-продуцента генно-инженерного белка-антигена Caf1 Y.pestis позволит получить, после наземной обработки, высокоочищенный белок Caf1 для практических и научных задач. Результаты КЭ будут использованы для получения в наземных условиях высокоочищенного препарата V-антигена слитого с полигистидиновым пептидом в качестве основного компонента молекулярных вакцин нового поколения против иерсиниозов, а также для направленного создания новых лекарственных препаратов, в том числе для лечения СПИДа и ряда опухолевых заболеваний.

В результате проведения 5-ти сеансов КЭ получены следующие основные результаты.

Установлено, что экспозиция рабочих культур, находящихся на скошенных косяках, в условиях воздействия факторов орбитального полета приводит к повышению уровня синтеза рекомбинантными клетками Е. coli HB101/pVHB62 целевого продукта V-антигена на 30% ± 10% по отношению к контрольным образцам, находившимся в наземных условиях в качестве контроля. Лиофильно высушенные образцы культур не отличались в опыте и контроле по уровню синтеза V-антигена.

V-антиген, выделенный из клеток рекомбинантного штамма Е. coli HB101/pVHB62, побывавших в условиях орбитального полета идентичен по молекулярной массе, спектральным и иммунохимическим свойствам V-антигену, полученному из контрольных культур, хранившихся в наземных условиях.

В результате КЭ «Астровакцина» получены клоны рекомбинантного штамма Е. coli HB101/pVHB62 с устойчивой повышенной экспрессией целевого продукта. Со штаммами продолжается селекционная работа.

Поставленные в ТЗ на КЭ задачи решены полностью. В 2011 г. выпущен итоговый отчет, инв. № 2346. КЭ Астровакцина» завершен. Анализ выполненных работ позволяет сделать вывод о возможности его выведении из состава «Долгосрочной программы научно-прикладных исследований и экспериментов на РС МКС».

В процессе выполнения КЭ « Астровакцина» ученые Института инженерной иммунологии сделали открытие в области естественного иммунитета, суть которого заключается в следующем.

Известно, что на поверхности иммунокомпетентных клеток постоянно экспрессируются рецепторы к гамма- интерферону (IFN-?R). При взаимодействии IFN-? с IFN-?R на молекуле IFN-? открывается сайт, обладающий способностью связываться с чужеродными антигенами, например, V-антигеном иерсиний (Kd = 10-10M). Сайт, обнаруженный на молекуле IFN-? гомологичен сайту связывания чужеродных бактериальных антигенов на молекуле Toll-like-2 рецепторов, принадлежащих к сторожевой распознающей системе естественного иммунитета. Образовавшийся тройной комплекс V-антиген-IFN?-IFN-?R поглощается иммунокомпетентной клеткой. При низких значениях pH в клетке происходит диссоциация комплекса. Освободившийся из тройного комплекса IFN? секретируется клеткой в свободном состоянии. IFN-?R вновь экспрессирутся на поверхности клетки. V-антиген используется клеткой для индукции адаптивного иммунитета. Приоритет этих исследований отражен в отечественных и зарубежных публикациях.

1. Abramov V M, Khlebnikov V S. Vasilicv A M.. Kosarev I V. Vasilenko. R N, Kulikova N L, Khodyakova AV, HvstigneevVi, Uversky V N, Motin V L. Smirnov G B. Brubaker R R. Attachment of LcrV from Yersinia pestis at Dual Binding Sites to Human TLR-2 and Human IFN-Receptor. 2007. J Proteome Research, 6, 2222-2231.

2. Abramov, V.M., V.S. Khlebnikov, A.M. Vasilicv, I.V. Kosarev. R.N. Vasilenko, N.L. Kulikova. V.L. Motin, G. B. Smimov, V.I. Evstigneev, N.N. Karkischenko V.N. Uversky, and R.R. Brubaker. A study of the interaction of Yersinia pestis virulence factors with 1L-1R/TLR recognition system: a key to the understanding of plaque pathogenesis mechanisms and the creation of specific protection means of a new generation. 2008. Frontiers in Research. National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Bethesda, MD (Vassil St. Georgiev. Series Editor). Humana Press, a part of Springer Science + Business Media, LLC, ISBN 978-1-934115-77-0, v. 1, pp. 215-225

3. Catherine A. Mueller, Petr Broz, Shirley A. Miiller, Philippe Ringler, Frarifoise Erne-Brand, Isabel Sorg, Marina Kuhn, Andreas Engel, Guy R. Cornells. 2005. The V-Antigen of Yersinia Forms a Distinct Structure at the Tip of Injectisome Needles. Science, v. 310, 674-676.

4. Derewenda U., Mateja A., Devedjiev Y., Routzahn K.M., Evdokimov A.G., Derewenda Z.S., Waugh D.S. 2004. The structure of Yersinia pestis V-antigen an essential virulence factor and mediator of immunity against plague. Structure, 12, 301-306.