Кристаллизатор

Кристаллизатор

Шифр эксперимента: Кристаллизатор
Информационная справка: is_kristallizator.docx
Направление НПИ: 1. Физико-химические процессы и материалы в условиях космоса
Секция КНТС: Космическое материаловедение
Наименование эксперимента: Кристаллизация биологических макромолекул и получение биокристаллических пленок в условиях микрогравитации
Цель эксперимента:

Получение данных о физических процессах кристаллизации белков для получения совершенных по структуре монокристаллов белков и биокристаллических пленок из объемного раствора на подложках с использованием эффекта искусственной эпитаксии; разработка и сравнение методик выращивания кристаллов биологических макромолекул методом встречной диффузии с использованием комплекта НА «JAXA PCG» и методом свободной диффузии и диффузии паров в кристаллизаторах «Модуль-1» и «Модуль-3» для кристаллизации белков в интересах фундаментальной и прикладной биологии, медицины, фармакологии и микроэлектроники

Описание эксперимента:

Хотя известны химические формулы большого количества биологических макромолекул, изучение их пространственной структуры является трудной задачей. Изучение трехмерных структур белков, ДНК, РНК позволяет получить информацию о механизмах их функционирования. Эти знания являются фундаментальными для новой области рационального проектирования лекарств, заменяя метод проб и ошибок.

На основе рентгеноструктурного анализа белковых монокристаллов можно создавать искусственные аналоги природных биообъектов или их активные фрагменты, которые далее можно использовать для производства лекарств, функционально значимых белков, биосенсоров, биочипов. Для определения точной структуры молекулы белка требуется разрешение порядка 1 A, так как только при таком разрешении можно различить водородные связи в молекуле белка и определить точную пространственную структуру молекулы. Точность определения изучаемой структуры лежит в прямой зависимости от совершенства используемых монокристаллов. Поэтому выращивание белковых высококачественных кристаллов требует улучшения известных и поиска новых методов кристаллизации белков. Среди методов, позволяющих улучшить качество белковых кристаллов, кристаллизация белков в условиях невесомости занимает особое место. На борту космического аппарата в условиях орбитального полета возникает уникальная окружающая среда для выращивания кристаллов – среда, свободная от воздействия гравитационных сил, которые могут нарушать тонкую структуру биокристаллов. Проведение экспериментов в невесомости, когда транспорт вещества к растущему кристаллу осуществляется посредством диффузии, дает возможность развить представления о механизмах роста кристаллов белков, что важно и для улучшения наземных технологий.

КЭ «Кристаллизатор» реализуется в два этапа. На первом этапе исследования проводились с использованием российского оборудования, в состав которого входило устройство для кристаллизации белков методом свободной диффузии («Модуль-1»), а также кристаллизационное устройство «Модуль-2», позволяющее получать биокристаллические пленки из объемного раствора на подложках с использованием эффекта искусственной (графо) эпитаксии. Первый этап исследований завершился в 2009 г. На втором этапе для роста кристаллов используется японский кристаллизатор «JAXA-PCG», где применяется метод встречной диффузии в капиллярах. На втором этапе для роста кристаллов используется японский кристаллизатор «JAXA-PCG», где применяется метод встречной диффузии в капиллярах. Запланировано проведение 18 сеансов КЭ «Кристаллизатор». На данный момент проведено 15 сеансов КЭ.

В КЭ решаются следующие задачи: ­

• отработка методик получения монокристаллов биологических макромолекул методом свободной диффузии и ориентирования кристаллитов, образующих пленку в условиях микрогравитации; ­

• отработка аппаратуры, отработка режимов и условий выращивания монокристаллов белков и биологических пленок; ­

• экспериментальная оценка эффективности и надежности используемой аппаратуры; ­

• отработка циклограммы КЭ для организации серийного выращивания биокристаллов и пленок в условиях микрогравитации; ­

• отработка методики и выращивание кристаллов биологических макромолекул методом встречной диффузии с использованием комплекта японской НА "JAXA PCG"; ­

• сравнение методов выращивания кристаллов биологических макромолекул методом встречной диффузии с использованием комплекта НА "JAXA PCG" и методом свободной диффузии в кристаллизаторе "Модуль-1".

Новизна эксперимента:

Космические эксперименты на борту различных космических объектов проводятся с середины 80-х годов прошлого столетия. За это время разными странами проведен значительный объем исследований, разработаны десятки образцов различных кристаллизаторов разной степени сложности, в том числе оснащенных современными средствами диагностики. Так в европейской установке PCDF (модуль Колумбус) в качестве инструментов диагностики используется метод динамического светорассеяния для наблюдения за процессами, предшествующими нуклеации (зародышеобразования) кристалла, а также интерферометр Маха-Зендера для наблюдения за изменением градиентов концентрации раствора вокруг растущих кристаллов белка. Ростовые камеры установки PCDF используются для наблюдения за количеством и скоростью роста отдельных кристаллов. Используя возможности изменения концентрации путем введения инъекций, можно создавать самые разнообразные условия роста. Несмотря на значительные достижения в этой области, теория кристаллизации биологических макромолекул все еще не достаточно развита, что не позволяет со всей определенностью прогнозировать условия кристаллизации различных белков. Зачастую для нового белка требуется проведение всего цикла экспериментальных исследований. С другой стороны современное наземное оборудование позволяет существенно ускорить это процесс. Скрининг (подбор условий кристаллизации) проводится с помощью автоматов, что позволяет использовать малые количества белковых растворов и существенно сократить время. Обычно процесс получения третичной структуры белка может занимать, в зависимости от опытности кристаллографа, интенсивности работы и других факторов, от нескольких месяцев до 2 лет. Сравнительный анализ результатов, полученных на Земле и в космосе, показывает, что в отдельных случаях в космосе удается получить структуры более совершенные, чем до этого удавалось на Земле, что позволяет улучшить разрешение при проведении рентгеноструктурного анализа в 1,5-2 раза.

Важной особенностью метода встречной диффузии через раствор вязкого буфера, используемого при выращивании кристаллов в капиллярах НА JAXA-PCG, является то, что в отличие от классического метода висячей или сидячей капли (hanging or sitting drop method), этот метод дает возможность изучения большого ряда условий кристаллизации в одном единственном эксперименте, поскольку концентрация осадителя меняется по мере продвижения вдоль капилляра с раствором белка. Таким образом, этот эксперимент эквивалентен проведению большого числа экспериментов с висячей каплей по фазовой диаграмме. Кроме того, процесс кристаллизации все время направлен в сторону равновесия и поэтому эксперимент встречной диффузии сам по себе ищет оптимальный сценарий кристаллизации. И, наконец, нет необходимости проверять кристаллы в разных каплях для поиска кристаллов с более высоким качеством. В эксперименте встречной диффузии самыми лучшими кристаллами являются те кристаллы, которые образовались в местах, далеких от точки раздела между протеином и осаждающим раствором.

В ходе космического эксперимента «Кристаллизатор» также была поставлена ранее никем не решавшаяся в космосе задача, связанная с новым направлением в молекулярной биоэлектронике – создание биокристаллических пленок. Такие пленки, обладающие широким спектром уникальных электрических и оптических свойств, перспективны для создания биокомпьютеров. Для того, чтобы биологические пленки имели воспроизводимые параметры, они должны быть монокристаллическими, или хотя бы частично упорядоченными. Это может быть достигнуто их эпитаксиальным наращиванием. Для эпитаксии нужна подходящая подложка, у которой параметр кристаллической решетки не отличается или лишь незначительно отличается от параметров решетки наращиваемого материала. Однако, параметры кристаллической решетки материалов, образованных биологическими макромолекулами, сильно отличаются от параметров неорганических материалов. Практически нет возможности найти неорганический материал, который имел бы равный или близкий к биологическому параметр решетки, что обеспечило бы эпитаксиальный рост биокристаллической пленки. Выход из этого положения может быть основан на «искусственной эпитаксии». Этот подход к кристаллизации был предложен в ИК РАН около 30 лет назад Н.Н.Шефталем. Он состоит в наращивании пленок на подложку, на поверхности которой создан кристаллографически-симметричный микрорельеф в виде систем взаимно-параллельных ступеней. Кристаллиты взаимодействуют со ступенями и осаждаются на них ориентированным образом в соответствии с принципом минимума энергии системы подложка-пленка. Эффективность такого подхода на Земле была продемонстрирована на ряде неорганических материалов, а также на биологических кристаллах.

В КЭ использовались подложки разных ориентаций с полосчатым микрорельефом. Проведены эксперименты по методу паровой диффузии, причем капля раствора прижимается к подложке мембраной, в которой созданы микропоры посредством бомбардировки её ядерными частицами, а раствор осадителя («противораствора») содержится в губчатой резине.

Научная аппаратура:

Для проведения эксперимента на первом этапе в период с 2005 по 2009 год использовался комплекс научной аппаратуры "Кристаллизатор", разработанный в ИК РАН, в состав которого входили кристаллизатор "Модуль-1" и кристаллизационное устройство "Модуль-3".

"Модуль - 1" (рис.1) - устройство с механическими затворами для выращивания монокристаллов белков методом свободной диффузии. Процесс кристаллизации начинается после открытия оператором механического затвора, разделяющего растворы белка и осадителя. Оборудование использовалось во время экспедиций МКС-11 - МКС-14, МКС-16 – МКС-19 ,МКС - 21/22.

Рисунок 1 – Контейнер с кристаллизатором "Модуль-1" Рисунок 2 – Кристаллизационное устройство "Модуль – 3"

Основные характеристики НА “Модуль-1”:

- габариты: диаметр не более 70 мм, высота не более 85 мм;

- масса – не более 0,450 кг;

- количество ячеек в обойме – 8 шт.;

- объем ячейки в зависимости от модификации от 10 до 70 мкл;

- диаметр капиллярной части ячеек от 2 до 4 мм;

- длина капиллярной части ячейки не более 30 мм.

- энергопотребление не требуется.

Конструкция прибора обеспечивает сохранность белков от момента заправки до начала процесса кристаллизации, проведение кристаллизации белков в течение 10-30 суток и последующую сохранность белков до возвращения прибора на Землю и передачи его представителю ИК РАН. Суммарное время сохранности белков 90 суток.

"Модуль-3" (рис. 2) предназначен для выращивания двумерных ориентированных пленок на подложках с нанесённым микрорельефом методом искусственной эпитаксии. Процесс начинается после открытия оператором механического затвора, разделяющего камеру кристаллизационных ячеек и камеру осадителя. Устройство использовалось во время экспедиции МКС-11 и МКС-12.

Основные характеристики НА “Модуль-3”:

- габариты модуля: диаметр не более 100 мм, высота – не более 85 мм;

- масса модуля – не более 0, 450 кг;

- количество ячеек в модуле – 12;

- размеры подложки в ячейке 5х5х0,5 мм.

- энергопотребление не требуется.

После доставки на борт РС МКС аппаратура размещалась в заданном месте. В зоне с температурой воздуха в диапазоне от 18 до 28°С. В первые сутки после стыковки экипажем выполнялась активация процесса кристаллизации, а перед возвратом аппаратуры на Землю – деактивация процесса. Во время проведения КЭ на Землю сообщались данные о температуре воздуха в зоне размещения кристаллизаторов. Всего проведено 7 сеансов эксперимента.

В настоящее время КНА «Кристаллизатор» в КЭ не используется.

С 2009 г. исследования продолжаются с использованием японского оборудования для кристаллизации белков PCRF (рис. 3), размещаемом на японском исследовательском модуле JEM («Кибо»).

Кристаллизационные ячейки. Блок кристаллизационных ячеек JCB. 4 блока JCB, упакованные в пластиковый пакет. Держатель для 4 блоков JCB (48 ячеек) с регистратором температуры.
Канистра (вмещает 3 держателя). Размещение контейнеров аппаратуры JAXA-PCG внутри блока PCRF для исследования процессов кристаллизации белков. Внешний вид блока PCRF стойки RYUTAI японского лабораторного модуля «Кибо».
Рисунок 3 – Конструктивные и функциональные элементы НА «JAXA-PCG.

PCRF состоит из канистры, внутри которой размещаются специальном образом упакованные кристаллизационные ячейки двух типов Granada (GCBs) и JAXA JCBs, и регистратора температуры. В общем случае элементарная кристаллизационная ячейка представляет собой пластиковый капилляр (рис. 4), содержащий белковый раствор, к одному из концов которого присоединяется трубка (втулка) с буферным раствором агарозы, которая в свою очередь присоединяется к цилиндрическому резервуару с раствором осадителя. Оба конца образуемой кристаллизационной ячейки и места соединения с втулкой запечатываются силиконовой смазкой и материалом аральдитом. В одной канистре может быть загружено 144 таких кристаллизационных ячейки.

Рисунок 4 – Схема формирования кристаллизационной ячейки.

Момент, когда фактически начинается эксперимент по кристаллизации, определяется толщиной загустевшего буферного раствора, через который должно диффундировать осаждающее вещество, до того как оно достигнет раствора протеина. То, что буферный раствор находится в густом состоянии делает эту выдержку времени нечувствительной к перемещениям, ускорениям или вибрациям на участке выведения. Этот интервал времени может длиться до 7 дней. Для активации аппаратуры не требуется никаких движущихся деталей и никаких электроприводных систем.

Диаметр капилляра – 1 мм. Объем белкового раствора 10 µl, объем осадителя – 180 µl.

Масса укладки с канистрой с теплоизоляционным вкладышем – не более 2,8 кг.

Габариты укладки при выведении - 290 x 227 x 186 мм для одного летного комплекта.

PCRF является активным устройством, представляющим собой инкубатор, который потребляет электрическую энергию, охлаждается холодной водой и требует коммуникационных интерфейсов.

Ожидаемые результаты:

Ожидается, что будут найдены условия, обеспечивающие образование совершенных кристаллов белков и биокристаллических пленок на подложке. Это позволит определять молекулярную структуру белков с высоким разрешением, что важно для выяснения функциональных свойств белков и последующего их использования для разработки лекарств в том числе с использованием drug design методов, для исследования физиологии человека, для расшифровки генома человека и др.

Полученные результаты:

«Модуль-1»

В период с 2005 по 2009 г. проведено восемь сеансов КЭ. Было отправлено в космос 112 ячеек с белковыми растворами (+пленки), исследовано более 20 белков и их комплексов, в том числе лизоцим, каталаза PVC, карбоксипептидаза, уридинфосфорилаза, агглютинин, инсулин человека, белки теплового шока из туберкулезной бактерии HSP-65, HSP-70, рекомбинантный гормон роста соматотропин, альфа-фетопротеин и др. Во всех сеансах размеры выращенных кристаллов были соразмерны или превосходили полученные на Земле. ~80% экспериментов признаны удачными. Дифракционное разрешение полученных кристаллов - от 3.0 до 1.5 A.

Благодаря отработанным и откорректированным условиям кристаллизации размеры кристаллов карбоксипептидазы были увеличены от 0,1 до 0,7 мм (рис.5). Была получена новая кристаллическая модификация этого белка, которая отсутствовала в наземных условиях.

Рисунок 5 – Кристаллы карбоксипептидазы-В, полученные в КЭ в период экспедиции МКС-14 (слева) и МКС 12 (справа). Снимки сделаны при одинаковом увеличении.

Также были усовершенствованы условия кристаллизации сиалированного инсулина и азидного комплекса формиатдегидрогеназы (рис.6), а также туберкулёзной пирофосфатазы из Micobacterium tuberculosis и пирофосфатазы холеры из Vibrio cholera.В результате чего были получены кристаллы белков, по размеру превосходящие выращенные в наземных условиях и пригодные для дальнейших рентгеноструктурных исследований.

Рисунок 6 – Кристаллы формиатдегидрогеназы с азидом натрия (МКС-17).

Кристаллы формиатдегидрогеназы с азидом натрия в форме призмы имели средний размер 0,7х0,3х0,3 мм, максимальный размер 1,0х0,7х0,7 мм. Кубические кристаллы имели в среднем длину ребра 0,3 мм, максимальная длина – 0,5 мм.

Расшифрована атомная структура белка туберкулёзной пирофосфатазы из Micobacterium tuberculosis. Установлено, что кристалл принадлежит к пространственной группе P6322, определено расположение молекулы цитрата, связанного в активном центре пирофосфатазы M.tuberculosis. Биологической активной единицей является гексамер (рис.7).

По данным рентгеноструктурного анализа кристаллов пирофосфатазы V.cholerae было установлено, что мозаичность кристаллов составляла 0,4-0,6 градуса. По сравнению с кристаллами, выращенными на Земле, кристаллы пирофосфатазы V.cholerae, выращенные в условиях микрогравитации были лучшего качества, образовывали меньше сростков и двойников. Толщина тригональных пластин была больше по сравнению с кристаллами, выращенными на Земле.

Рисунок 7 - Гексамер – биологически активная единица пирофосфатазы M.tuberculosis.

С использованием космических кристаллов получены высококачественные дифракционные наборы, и впервые расшифрованы пространственные структуры формиатдегидрогеназы Arabidopsis thaliana с высоким разрешением до 1,3 A.

Получены кристаллы фосфопантетеин аденилилтрансферазы Mycobacterium tuberculosis (трансфераза, РРАТ) в комплексе с коферментом А. Установлена структура с разрешением 2,1 A с использованием наземных кристаллов. С кристаллов этого комплекса, и комплекса РРАТ с дифосфокоферментом-А, выращенных в невесомости, собраны дифракционные набора при разрешении 1,55 A. Такое высокое разрешение достигнуто впервые.

Впервые в наземных и космических условиях выращены кристаллы мутантной формы карбоксипептидазы-Т с шестью заменами в активном центре. Собраны дифракционные наборы с наземных кристаллов с разрешением до 2,1 A , и с космических – с разрешением до 1, 6 A.

По результатам исследований в Международный банк белковых структур (PDB) в 2009 году были депонированы атомные координаты пяти белковых молекул:

- 3E7Y - космический цинк-инсулин (1,6 A );

- 3E7Z земной цинк-инсулин (2,0 A );

- 3I3Z космический кубический инсулин (1,55 A), выращенный из комплекса с полисиаловой кислотой в невесомости;

- 3I40 земной кубический инсулин (1,85 A), выращенный из комплекса с сиаловой кислотой на Земле;

- 3JTM формиатдегидрогеназа Arabidopsis thaliana.

«Модуль-3»

В качестве модельного материала для выращивания биопленок в условиях микрогравитации в период экспедиций МКС-11 и МКС-12 на Российском сегменте МКС использовали каталазу PVC.

На подложки окисленного кремния с помощью микродозатора были нанесены капли белкового раствора объемом 14 мкл : 7 мкл раствора PVC (концентрация 42,7 мг/мл в 0,1 М натрий-ацетатном буфере pH 5,2) и 7 мкл 1,3 М (NH4)2SO4 в 0,1 М натрий-ацетатном буфере с pH 5,2. Белковый раствор прижимали к подложке перфорированной тефлоновой пластинкой, на которой закрепляли полимерную мембрану с микропорами. Таким образом, был обеспечен обмен между осадителем и раствором белка посредством паровой диффузии и сведена к минимуму вероятность смещения белкового раствора с подложки при сильных ускорениях на стадии запуска научной аппаратуры на орбиту и возвращения на Землю.

В камеру осадителя была помещена микрогубка, пропитанная раствором сернокислого аммония (8,5 мл 1,3 М (NH4)2SO4 в натрий-ацетатном буфере с pH 5,2).

Кристаллизационное устройство Модуль-3 в условиях космического эксперимента функционировало нормально - оставалось герметичным, предложенные в данном проекте идеи использования пористого "Фармасорб" в камере осадителя и перфорированной мембраны для прижима белкового раствора в кристаллизационной ячейки себя оправдали.

Оптические исследования кристаллов PVC, выращенных в условиях микрогравитации, показали, что кристаллы прозрачные, без трещин, хорошо огранены, имеют в большинстве своем одинаковые размеры ~ 50 мкм и пригодны для структурных исследований. Все (рис. 8) или почти все кристаллы белка каталазы ориентированы вдоль полос микрорельефа. При срастании одинаково ориентированных кристаллитов образовалась квазимонокристаллическая пленка площадью до 0,5 мм2.

Рисунок 8.

На рис. 9 представлены биокристаллы каталазы, выращенные на подложке окисленного кремния ориентации (110) с прерывистым полосчатым микрорельефом. Хорошо видно, что ориентированные рост пленок обеспечивался присоединением миникристаллических блоков (кристаллитов) к торцам макроступеней, созданных на поверхности неорганической подложки искусственным путем (фотолитографией).

Рисунок 9.

Таким образом, в результате космических экспериментов по кристаллизации биологических объектов в условиях микрогравитации удалось получить ряд кристаллов белков, которые значительно превышают по размеру и качеству их наземные аналоги, а также с высокой точностью удалось определить атомно-молекулярную структуру целого ряда белков и найти их активные центры.

«JAXA-PCG»

За период проведенных исследований с НА «JAXA-PCG» с 2009 по 2018 годы получены кристаллы 196 белков и их комплексов. Получены структурные данные по более чем 150 белкам. Депонированы в PDB данные по 25 белковым структурам. При проведении экспериментов по кристаллизации в невесомости отработаны методики выделения и очистки более 220 белков. С использованием скрининга методом диффузии паров растворителя найдены условия кристаллизации для всех очищенных белков. Для всех белков найденные условия оптимизированы для выращивания кристаллов методом встречной диффузии в капилляре. Отработаны методики предполётной подготовки белковых препаратов для проведения кристаллизационных экспериментов в условиях невесомости методом встречной диффузии. Совместно с японским аэрокосмическим агентством JAXA проведено 14 сеансов КЭ «Кристаллизатор». Завершена бортовая реализация 15-ого сеанса. Освоена разработанная японским космическим агентством технология кристаллизации белковых препаратов с использованием метода встречной диффузии в капиллярах. В сеансах выращены пригодные для рентгеноструктурных исследований кристаллы белков и их комплексов с функционально важными лигандами. С использованием синхротрона третьего поколения SPring-8 (Япония) и соответствующих пакетов программ собраны и обработаны дифракционные наборы от выращенных кристаллов исследуемых белков. По дифракционным наборам, собранным от «космических» кристаллов с использованием комплекса программ ССР4 решены и уточнены в интервале разрешения 0,99-2,7 А пространственные структуры 105 природных белков, их мутантных форм и их комплексов с функциональными лигандами. Анализ экспериментов показал, что используемая технология кристаллизации в невесомости методом встречной диффузии позволяет избежать двойникования кристаллов, приводит к увеличению размера кристаллов и повышает их дифракционное качество. Координаты, уточнённые при более высоком разрешении, позволяют построить более точные атомные модели, а при использовании их в качестве стартовых для компьютерного моделирования - увеличить точность расчётов. Методы компьютерного моделирования, которые в ряде случаев могут сократить и даже заменить лабораторный эксперимент, всё шире применяются при исследовании функционирования макромолекул. Проведен анализ установленных пространственных структур и получены новые знания о механизмах катализа белками-ферментами. Ферменты являются природными биокатализаторами и находят все более широкое применение в нашей жизни ­

- 3RFF – фософопантетеинаденилтрансфераза из туберкулезной палочки в свободном виде (PPAT Mt), 1,76 A; ­

- 3RHS - PPAT Mt с природным ингибитором коэнзимом А (CoA), 1,59 A; ­

- 3RBA - комплекс PPAT Mt с продуктом катализируемой РРАТ реакции дефосфокоэнзимом А (dpCoA), 1,59 A; ­

- 3UC5 – комплекс с ATP, одним из субстратов реакции, 1,7 A; ­

- 3QNV – карбоксипептидаза wt (протеаза широкой специфичности), 1.69 A; ­

- 3PRT – мутант карбоксипептидазы по связывающему центру (КПТ5), 1.66 A.

Для белка алкогольдегидрогеназы 1998 из термофильной археи Thermococcus sibiricu, кристаллы удалось вырастить только в космосе и структура получены впервые. Для белка цитохром с нитритредуктазы из гипертермофильной бактерии Thioalkalivibrio paradoxus (рис. 10, 11) впервые удалось получить кристаллы без двойникования, что положительным образом сказалось на качестве полученной структуры. При снятии наборов интерес представлял эксперимент, при котором съемка проводилась за короткий промежуток времени (общее время экспозиции не превышало 3 мин). При съемке в таком режиме предполагалось получить структуру окисленной формы фермента, т.к известно, что рентгеновское излучение восстанавливает атомы металлов в ферментах.

Рисунок 10 - Капилляры с кристаллами цитохром с нитритредуктазы из бактерии T.nitratireducens после прилета. Рисунок 11 - Связывание сульфит-иона в активном центре цитохром с нитритредуктазы из бактерии T.nitratireducens. Оmit-синтез карты электронной плотности (2Fo-Fc), уровень срезки – 1?. Указаны водородные связи. Ион железа гема и ион кобальта показаны коричневым, ион кальция и протопорфирин гема 4 - серым.

Рисунок 12 - Кристаллы уридинфосфорилазы из бактерии S.oneidensis после прилета. Рисунок 13 - Пространственная структура уридинфосфорилазы из бактерии S.oneidensis при разрешении 0,95 A.

Рисунок 14 – Электронная плотность в активном центре уридинфосфорилазы при разрешении 0,95 A.

Для уридинфосфорилазы из Shewanella oneidensis получены данные с ультравысоким разрешением – 0,95 A (рис. 12, 13). Ранее, в земных экспериментах были получены кристаллы, дифрагирующие не выше 1.7А. Полученные в космическом эксперименте данные позволяют получить новые знания в части организации тонкой структуры активного центра фермента, т.к делают возможным определение положений отдельных атомов водорода (рис. 14), что невозможно при разрешении выше 1А. Это перспективный фермент для создания биокатализаторов биотехнологического синтеза нуклеозидов - потенциальных противовирусных и противораковых лекарств.

Для белка альдегиддегидрогеназы из термофильной археи A.sacharovorans ранее (в наземных экспериментах) были получены наборы с разрешением 2,4 A. Данный фермент участвовал в четвертом сеансе эксперимента (JAXA#4). С выращенных в ходе выполнении JAXA#4 кристаллов были сняты наборы до разрешения 1,8 A, что является значительным улучшением по сравнению с наземными данными.

Большой цикл исследований проведен для таких ферментов и их комплексов с ключевыми лигандами, как фосфопантетеин аденилтрансферазы Mycobacterium tuberculosis (PPAT Mt), карбоксипептидазы Т, тимидинфосфорилазы (рис. 15-20).

Рисунок 15 - Кристалл комплекса РРАТ MT/ДФСоА, выращенный в капилляре (JAXA#1). Рисунок 16 - Фрагмент электронной плотности PPAT Mt/ДФСоА, разрешение 1.5A (JAXA#1).

Рис. 17 - Гексамерная молекула PPAT Mt. Рис. 18 - Тример PPAT Mt с CoА в активном центре.

Рис.19 - Мономер PPAT Mt с CoА в активном центре. Рис. 20 - Мономер PPAT Mt с dpCoА в активном центре.

Исследования с этими белковыми комплексами были продолжены и во время сеанса JAXA#4, проводившегося в период 28 экспедиции на МКС с 21 июня по 16 сентября 2011 года.

В эксперименте JAXA#4 изучались белки: PPAT Mt; PPAT Mt в комплексе с 4' фосфопантетеином и в комплексе с 4'-фосфопантетеином и ATP; карбоксипептидаза Т из Termoactinomyces vulgaris WT в свободном виде и в комплексах с ингибиторами BOC-L-лейцином и -Z-L-лизином; мутантная форма карбоксипептидазы СРТ L254N в свободном виде и в комплексе с BOC-L-лейцином и -Z- L-лизином; тимидинфосфорилаза в комплексах с ингибиторами 3’-амино-2’-F-дидезокситимидин и 3’-амино-2’-дидезокситимидин, фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза I E.coli; фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза I в комплексе с неорганической пирофосфотаза E.coli; антитела на фуллерен С60; алкогольдегидрогеназа из T.sibiricus в комплексе с 1.6-гександиолом; никотинамидаза из A.sacharovorans; лакказа из B.aclada; альдегиддегидрогеназа из Pyrobacullum sp.; ДНК-лигаза из F.fontis в комплексе с АТФ и олигонуклеотидами; бета-гликозидаза из A.sacharovorans. В результате проведения рентгеноструктурного анализа с использованием источника синхротронного излучения Spring-8 (Япоия) было получено 37 наборов дифракционных данных с разрешением 1,29 – 2,9 A, пригодных для проведения дальнейшего структурного анализа. Практически для всех исследованных комплексов наборы данных были получены впервые, для ряда белков кристаллы, выращенные в космосе, обладали существенно лучшими характеристиками (например, для белка карбоксипептидазы B), а некоторые комплексы кристаллов (например, PPAT Mt c АТФ) удалось вырастить только в космосе.

Ниже приведены фотографии кристаллов белков, полученных в ходе выполнения 4 сеанса КЭ JAXA-PCG.

Рис. 21 - Капилляр с кристаллами лакказы из B.aclada. Рис. 22 - Капилляр с кристаллами альдегиддегидрогеназы из Pyrobacullum sp.

Рис. 23 - Капилляр с кристаллами бета-гликозидазы из A.sacharovorans. Рис. 24 - Капилляр с кристаллами алкогольдегидрогеназы из T.sibiricus в комплексе с гександиолом.

Рис. 25 - Капилляр с кристаллами комплекса TP с ингибитором 2. Рис. 26 - Капилляр с кристаллами фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы I в комплексе с неорганической пирофосфатазой E.coli.

Сроки проведения: 2005-2020 гг.
Состояние эксперимента: Реализуется
Организация постановщик: ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН (до 2015 года Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН)
Организации участники: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт», Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Институт физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского МГУ.
Научный руководитель: Волошин А.Э., заместитель директора ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, к.ф.-м.н.
Публикации по эксперименту: 1. Байдусь А.Н., Гребенко А.И., Жухлистова Н.Е., Кислицын Ю.А., Куранова И.П., Ляшенко А.В., Муравьева Т.И., Самыгина В.Р., Смирнова Е.А., Сосфенов Н.И., Степаненко В.Н., Чупова Л.А. Эксперименты по кристаллизации белков на Российском сегменте международной космической станции // Космонавтика и ракетостроение, 2007, № 4 (49), С.13–17.

2. Growth of biocrystalline films of PVC catalase in space using artificial epitaxy (graphoepitaxy). Е.И.Гиваргизов, А.И. Гребенко, Л.А.Задорожная, В.Р. Мелик-Адомян. Journal of Crystal Growth vol. 310, #4 (2008) pp. 847-852.

3. Тихонова Т.В., Слуцкая Э.С., Филимоненков А.А., Бойко К.М., Клейменов С.Ю., Конарев П.В., Поляков К.М., Свергун Д.И., Трофимов А.А., Хоменков В.Г., Звягильская Р.А., Попов В.О. Выделение и олигомерный состав цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens // Биохимия. – 2008. – Т.73. – N2. – С.202-209.

4. Konstantin M. Polyakov, Konstantin M. Boyko, Tamara V. Tikhonova, Alvira Slutsky, Alexey N. Antipov, Renata A. Zvyagilskaya, Alexandre N. Popov, Viktor S. Lamzin and Vladimir O. Popov High-Resolution Structural Analysis of a Novel Octaheme Cytochrome c Nitrite Reductase from the Haloalkaliphilic Bacterium Thioalkalivibrio nitratireducens // J. Mol. Biol. 2009. v.389, N5, 846-862.

5. Смирнова Е.А., Кислицын Ю.А., Сосфенов Н.И., Ляшенко A.В., Попов А.Н., Байдусь А.Н., Тимофеев В.И., Куранова И.П. Выращивание кристаллов белков на российском сегменте международной космической станции // Кристаллография, 2009,Т. 54, № 5, С. 948–958.

6. Родина Е.В., Самыгина В.Р., Воробьева Н.Н., Ситник Т.С., Курилова С.А., Назарова Т.И. Структурные и кинетические особенности неорганической пирофосфатазы семейства I из vibrio cholerae. Биохимия. 2009. Т. 74. № 7. С. 906-915.

7. Timofeev V.I., Chuprov–Netochin R.N., Samigina V.R., Bezuglov V.V., Miroshnikov K.A., Kuranova I.P. X–ray investigation of gene–engineered human insulin crystallized from a solution containing polysialic acid // Acta Сrystallographica, 2010, V. F66, P. 259–263.

8. Шабалин И.Г., Серов А.Е., Скиргелло О.Е., Тимофеев В.И., Самыгина В.Р., Попов В.О.,Тишков В.И., Куранова И.П. Рекомбинантная формиатдегидрогеназа Arabidopsis thaliana. Получение, кристаллизация в условиях невесомости и предварительное рентгеновское исследование кристаллов // Кристаллография, 2010, Т. 55, № 5, С. 855–859.

9. Акпаров В. Х., Гришин А. М., Тимофеев В.И., Куранова И.П. Получение, кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование мутанта карбоксипептидазы Т с карманом первичной специфичности карбоксипептидазы В // Кристаллография, 2010, 55, № 5, С. 851–854.

10. Тимофеев В.И., Смирнова Е.А., Чупова Л.А., Есипов Р.С., Куранова И.П. Приготовление кристаллического комплекса фосфопантетеин адденилил трансферазы Mycobacterium tuberculosis и исследование его пространственной структуры при разрешении 2.1 Å // Кристаллография, 2010, Т. 55, № 6, С. 1058–1066.

11. Жукова Ю.Н., Ляшенко А.В., Лашков А.А., Гурьянов В.А., Кобыльская Ю.В., Жухлистова Н.Е., Михайлов А.М. Атомная структура нелигандированной молекулы лакказы из Сerrena maxima с разрешением 1.76 Å и ее комплексов с молекулярным кислородом и пероксидом водорода.// Кристаллогафия, 2010, т. 55, № 3, с.472-483.

12. Trofimov A.A., Polyakov K.M., Boǐko K.M., Filimonenkov A.A., Tikhonova T.V., Popov V.O., Dorovatovskiǐ P.V, Koval'chuk M.V. Structure of octaheme cytochrome c nitrite reductase from thioalkalivibrio nitratireducens in a complex with phosphate. 2010. Crystallography Reports, 55, 1, 58-64.

13. Tamara V Tikhonova, Konstantin M Polyakov, Konstantin M Boyko, Tatiana N Safonova and Vladimir O Popov. Octaheme cytochrome c nitrite reductase. 2010. Handbook of Metalloproteins.

14. Trofimov AA, Polyakov KM, Boyko KM, Tikhonova TV, Safonova TN, Tikhonov AV, Popov AN, Popov VO. Structures of complexes of octahaem cytochrome c nitrite reductase from Thioalkalivibrio nitratireducens with sulfite and cyanide // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010 Oct; 66(Pt 10):1043-1047/

15. Акпаров В. Х.,Тимофеев В. И., Куранова И.П. Пространственная структура рекомбинантной карбоксипептидазы т из Thermoactynomyces vulgaris, не содержащей связанных ионов кальция // Кристаллография, 2011, Т. 56, № 4, С. 641–647.

16. Куранова И.П., Смирнова Е.А., Абрамчик Ю.А., Чупова Л. А., Есипов Р.С., Акпаров В.Х., Тимофеев В.И., Ковальчук М.В. Выращивание кристаллов фосфопантетеин аденилилтрансферазы, карбоксипептидазы Т и тимидинфосфорилазы на международной космической станции методом встречной диффузии в капилляре// Кристаллография, 2011, Т. 56, № 5, С. 944–951.

17. Petrova T, Bezsudnova E.Y, Boyko K.M., Mardanov A.V., Polyakov K.M., Volkov V.V., Kozin M., Ravin N.V., Shabalin I.G., Skryabin K.G., Stekhanova T.N., Kovalchuk M.V., Popov V.O. ATP-dependent DNA ligase from Thermococcus sp. 1519 displays a new arrangement of the OB-fold domain. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2012. 68(Pt 12):1440-1447.

18. Tikhonova T, Tikhonov A, Trofimov A, Polyakov K, Boyko K, Cherkashin E,Rakitina T, Sorokin D, Popov V. Comparative structural and functional analysis of two octaheme nitrite reductases from closely related Thioalkalivibrio species. FEBS J. 2012 279(21):4052-4061.

19. Anton A. Trofimov, Konstantin M. Polyakov, Tamara V. Tikhonova, Alexey V. Tikhonov, Tatyana N. Safonova, Konstantin M. Boyko, Pavel V. Dorovatovskii, Vladimir O. Popov. Covalent modifications of catalytic tyrosine in octaheme cytochrome c nitrite reductase and their effect on the enzyme activity. Acta Crystallographica (2012) Sect.D, v.68, 144–153

20. Горбачева М.А., Ярош А.Г., Дороватовский П.В., Ракитина Т.В., Бойко К.М., Корженевский Д.А., Липкин А.В., Попов В.О., Шумилин И.А. Новый подход к исследованию структурно-функциональных свойств белков с неизвестными функциями (2012). Биоорганическая химия, Т. 38, № 1, с. 99-105.

21. Safonova T.N., Mordkovich N.N., Polyakov K.M., Manuvera V.A., Veiko V.P., Popov V.O. Crystallization of uridine phosphorylase from Shewanella oneidensis MR-1 in the laboratory and under microgravity and preliminary X-ray diffraction analysis // Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2012 1;68 (Pt 11):1387-1389.

22. Ekaterina Y. Bezsudnova, Konstantin M. Boyko, Konstantin M. Polyakov, Pavel V. Dorovatovskiy, Tatiana N. Stekhanova, Vadim M. Gumerov, Nikolai V. Ravin, Konstantin G. Skryabin, Michael V. Kovalchuk, Vladimir O. Popov. Structural insight into the molecular basis of polyextremophilicity of short-chain alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sibiricus // Biochimie, 2012, 94(12):2628-2638.

23. Тимофеев В.И., Смирнова Е.А., Чупова Л.А., Есипов Р.С., Куранова И.П. Пространственная структура фосфопантетеин аденилилтрансферазы из Мycobacterium tuberculosis в апо–форме и в комплексах с коферментом А и с дефосфокоферментом А // Кристаллография, 2012, Т. 57, № 1, С. 26–34.

24. Kuznetsov S.A., Kuranova I.P., Golyshev S.A., Rudenskaya Yu.A., Isaev V.A., Rudenskaya G.N. A novel endogenous inhibitor from the hepatopancreas of the kamchatka crab paralithodes camtschaticus // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2012. Т. 38. № 3. С. 290-297.

25. Timofeev V.I., Smirnova E.A, Chupova L.A., Esipov R.S., Kuranova I.P. X–ray study of the conformational changes in the molecule of phosphopantetheine– adenylyltransferase from Mycobacterium tuberculosis during the catalyzed reaction // Acta Crystallographica, Section D, D68, 2012, Р. 1660–1670.

26. Тимофеев В.И., Кузнецов С.А., Акпаров В.Х., Честухина Г.Г., Куранова И.П. Пространственная структура карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces vulgaris в комплекса с N–БОК–L–лейцином // Биохимия, 2013, Т. 78, № 3, С. 338–347.

27. Тимофеев В.И., Абрамчик Ю.А., Фатеев И.В., Жухлистова Н.Е., Муравьева Т.И., Куранова И.П., Есипов Р.С. Пространственная структура тимидинфосфорилазы E.coli в комплексе с 3`– азидо–2`–фтор–2`,3`–дидезоксиуридин // Кристаллография, 2013, Т. 58, № 6, С. 828–839.

28. К. М. Бойко, А. В. Липкин, В. О. Попов, М. В. Ковальчук От гена к структуре. Белковая фабрика нбик-центра курчатовского института. 2013, Кристаллография, т. 58, №3, 431-437

29. Samygina VR, Sokolov AV, Bourenkov G, Petoukhov MV, Pulina MO, Zakharova ET, Vasilyev VB, Bartunik H, Svergun DI. Ceruloplasmin: macromolecular assemblies with iron-containing acute phase proteins. 2013, PloS One, 8, e67145

30. Samygina VR, Ochoa-Lizarralde B, Popov AN, Cabo-Bilbao A, Goni-de-Cerio F, Molotkovsky JG, Patel DJ, Brown RE, Malinina L. Structural insights into lipid-dependent reversible dimerization of human GLTP. 2013, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,69, 603-616.

31. Timofeev Vladimir , Abramchik Yulia, Zhukhlistova Nadezda, Muravieva Tatiana, Fateev Ilya, Esipov Roman and Kuranova Inna. 3’–Azidothymidine in the active site of Escherichia coli thymidine phosphorylase: the peculiarity of the binding on the basis of X-ray study// Acta Cryst. 2014, D70, 1155–1165

32. V.Kh.Akparov, V.I.Timofeev, I.G.Khaliullin, V.Svedas, G.G.Chestukhina, I.P.Kuranova. The new mechanism of substrate recognition by metallocarboxypeptidases. (2014) J.Med.Res.Dev. 3(4) p. 200.

33. К.М. Бойко, М.А. Горбачева, Т.В. Ракитина, Д.А. Корженевский, П.В. Дороватовский, А.В. Липкин, В.О. Попов. Идентификация лиганда в структуре белка с неизвестной функцией STM4435 из Salmonella typhimurium. 2014. Доклады Академии Наук, т.457, №1, стр.107-110.

34. И.П. Куранова, М.В. Ковальчук. Кристаллы для изучения белковых структур. Природа. 2014. №3. Стр. 12-21.

35. В. И. Стрелов, И. П. Куранова, Б. Г. Захаров, А. Э. Волошин. Космическая кристаллизация: результаты и перспективы (обзор). Кристаллография, 2014, том 59, № 6, с. 863–890.

36. Куранова И.П., Ковальчук М.В. Кристаллы для изучения белковых структур // Природа. 2014. № 3. С. 12-21

37. И. П. Куранова. Фосфопантетеинаденилилтрансфераза Mycobacterium tuberculosis и тимидинфосфорилаза E. coli – белки-мишени для действия лекарств: пространственная структура и механизм действия. Вестник РФФИ. 2014, 2(82), с.45-55.

38. Sokolov AV, Zakharova ET, Kostevich VA, Samygina VR, Vasilyev VB. Lactoferrin, myeloperoxidase, and ceruloplasmin: complementary gearwheels cranking physiological and pathological processes. Biometals. 2014, V.27, 815-828

39. Akparov, V. Kh.; Timofeev, V. I.; Kuranova, I. P. "Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of porcine carboxypeptidase B" Crystallography Reports (2015) Volume: 60 Issue: 3 Pages: 367-369 DOI: 10.1134/S1063774515030025

40. Akparov, Valery Kh, Timofeev, Vladimir I., Khaliullin, Ilyas G., Svedas, Vytas, Chestukhina, Galina G., Kuranova, Inna P. "Structural insights into the broad substrate specificity of carboxypeptidase T from Thermoactinomyces vulgaris" Source: Febs Journal (2015) Volume: 282 Issue: 7 Pages: 1214-1224 DOI: 10.1111/febs.13210

41. V. Akparov, N. Sokolenko, V. Timofeev and I. Kuranova "Structure of the complex of carboxypeptidase B and N-sulfamoyl-L-arginine" Acta Crystallographica Section F-Structural Biology Communications (2015) Volume: 71 Pages: 1335-1340 DOI: 10.1107/S2053230X15016799

42. Abramchik, Yu A.; Timofeev, V. I.; Zhukhlistova, N. E.; et al. "Purification, Crystallization, and Preliminary X-ray Diffraction Study of Purine Nucleoside Phosphorylase from E-coli" Crystallography Reports (2015) Volume: 60 Issue: 4 Pages: 521-524 DOI: 10.1134/S1063774515040021

43. V. I. Timofeev , Yu. A. Abramchik, N. E. Zhukhlistova, and I. P. Kuranova “Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Study of Phosphoribosyl Pyrophosphate Synthetase from E. Coli” (2015) Volume: 60, Issue: 5, pp. 748–751 DOI: 10.1134/S1063774515050181

44. V. I. Timofeev, L. A. Chupova, R. S. Esipov, and I. P. Kuranova “Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Study of Phosphopantetheine Adenylyltransferase from M. Tuberculosis Crystallizing in Space Group P32” (2015) Volume: 60, Issue: 5, pp. 745–747 DOI: 10.1134/S10 6377451505017X

45. К.М. Бойко, В.О. Попов, М.В. Ковальчук «Перспективные методы кристаллизации макромолекул, уменьшающие конвекционный транспорт вещества к растущему кристаллу» // Успехи химии (обзор), 2015, 84, 853-859.

46. Timofeev, V.I., Slutskaya, E.A., Korzhenevskiy, D.A., Gorbacheva, M.A., Boyko, K.M., Rakitina, T.V., Lipkin, A.V., Popov, V.O. «Crystal structure of recombinant prolidase from Thermococcus sibiricus at P21221 spacegroup» // Acta Cryst. F71, 2015, V.71(8): 951-957.

47. Isolation, Purification, Crystallization, and Preliminary X-ray Diffraction Study of the Crystals of HU Protein from M. gallisepticum A. Yu. Nikolaeva, V. I. Timofeev, K. M. Boiko, D. A. Korzhenevskii, T. V. Rakitina, P. V. Dorovatovskii, and A. V. Lipkin Crystallography Reports, 2015, Vol. 60, No. 6, pp. 880–883.

48. Tatiana Petrova, Ella Slutskaya, Konstantin Boyko, Olga Sokolova, Tatiana Rakitina, Dmitry Korzhenevskiy, Marina Gorbacheva, Ekaterina Bezsudnova and Vladimir Popov «The localization of Trp residues on the surface of the dodecamer of the aminopeptidase APDkam598 from the archaeon Desulfurococcus kamchatkensis» // Acta Cryst. F., 2015, 71 (3), 277-285.

49. Konstantin Boyko, Marina Gorbacheva, Tatiana Rakitina, Dmitry Korzhenevskiy, Anna Vanyushkina, Dmitry Kamashev, Alexey Lipkin and Vladimir Popov. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the histone-like HU protein from Spiroplasma melliferum KC3 // Acta Cryst. F., 2015, 71, 24–27.

50. А. Ю. Николаева, В. И. Тимофеев, К. М. Бойко, Д. А. Корженевский, Т. В. Ракитина, П. В. Дороватовский, А. В. Липкин. Выделение, очистка, кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование кристаллов HU-белка из M. Gallisepticum // Кристаллография, 2015, 60(6), 922-925.

51. Malinina L, Simanshu DK, Zhai X, Samygina VR, Kamlekar R, Kenoth R, Ochoa-Lizarralde B, Malakhova ML, Molotkovsky JG, Patel DJ, Brown RE. Q Rev Biophys. 2015, V.48, 281-322.

52. Kostevich VA, Sokolov AV, Grudinina NA, Zakharova ET, Samygina VR, Vasilyev VB. Interaction of macrophage migration inhibitory factor with ceruloplasmin: role of labile copper ions. Biometals, 2015, V.28, p 817-826.

53. Recombinant phosphoribosyl pyrophosphate synthetases from Thermus thermophilus HB27: Isolation and properties. Esipov, R. S.; Abramchik, Yu. A.; Fateev, I. V.; Muravyova, T. I.; Artemova, K. G.; Konstantinova, I. D.; Kuranova, I. P.; Miroshnikov, A. I., Russian journal of bioorganic chemistry, 2016, V. 42 I. 5 p. 512-521

54. Timofeev, V. I.; Abramchik, Yu. A.; Zhukhlistova, N. E.; et al. Three-dimensional structure of phosphoribosyl pyrophosphate synthetase from E-coli at 2.71 angstrom resolution Crystallography Reports Volume: 61 Issue: 1 Pages: 44-54 Published: JAN 2016

55. Timofeev, V. I.; Abramchik, Yu. A.; Zhukhlistova, N. E.; et al. Three-dimensional structure of E-Coli purine nucleoside phosphorylase at 0.99 resolution Crystallography Reports Volume: 61 Issue: 2 Pages: 249-257 Published: MAR 2016 Protein crystallization under microgravity conditions.

56. K. M. Boyko V. I. Timofeev V. R. Samygina .; et al. Analysis of the results of Russian experiments performed on the International Space Station in 2005−2015 Author(s): Source: Crystallography Reports Volume: 61 Issue: 5 Pages: 718-729 Published: SEP 2016

57. К. М. Бойко, В. И. Тимофеев, В. Р. Самыгина, И. П. Куранова, В.О. Попов, М.В. Ковальчук. Кристаллизация белков в условиях микрогравитации. Анализ результатов российских экспериментов на МКС В 2005–2015 гг., Кристаллография, 2016, том 61, № 5, с. 691–702

58. Ekaterina Bezsudnova, Tatiana Petrova, Natalia Artemova, Konstantin Boyko, Ivan Shabalin, Tatiana Rakitina, Konstantin Polyakov, Vladimir Popov «NADP-dependent aldehyde dehydrogenase from archaeon Pyrobaculum sp.1860: structural and functional features» Archaea, 2016, doi:10.1155/2016/9127857.

59. Konstantin Boyko, Tatiana Stekhanova, Alena Nikolaeva, Andrey V. Mardanov, Andrey L. Rakitin, Nikolai V. Ravin, Ekaterina Bezsudnova and Vladimir Popov «First structure of archaeal branched-chain amino acid aminotransferase from Thermoproteus uzoniensis specific for L-amino acids and R-amines» // Extremophiles, 2016, 20(2), 215–225.

60. Konstantin Boyko, Tatiana Rakitina, Dmitry Korzhenevskiy, Anna Vlaskina, Yuliya Agapova, Dmitry Kamashev, Sergey Kleymenov, Vladimir Popov. Structural basis of high thermal stability of histone-like HU protein from mollicute Spiroplasma melliferum KC3 // Scientific Reports, 2016, 6, 36366; doi: 10.1038/srep36366.

61. Konstantin M. Boyko, Marina A. Gorbacheva, Dmitry A. Korzhenevskiy, Maria G. Alekseeva, Dilara A. Mavletova, Natalia V. Zakharevich, Sergey M. Elizarov, Natalia N. Rudakova, Vladimir O. Popov, Valery N. Danilenko. Structural characterization of the novel aminoglycoside phosphotransferase AphVIII from Streptomyces rimosus with enzymatic activity modulated by phosphorylation // Biochemical and Biophysical Research Communications, 2016, 477(4), 595–601.

62. Бончук А.Н., Качалова Г.С., Бойко К.М., Максименко О.Г., Георгиев П.Г. N-концевой мультимеризующий домен инсуляторного белка ctcf drosophila melanogaster имеет компактную пространственную организацию при отсутствии вторичной структуры // Актуальные вопросы биологической физики и химии, 2016, 1, 243-245

63. Oksana M. Subach,, Natalia V. Barykina, Kiryl D. Piatkevich, Vladimir P. Sotskov, Marina A. Roshchina, Tatiana A. Kunitsyna, Aleksey Y. Malyshev, Anna M. Varizhuk, Galina E. Pozmogova, Konstantin V. Anokhin, Grigori N. Enikolopov and Fedor V. Subach. Enhanced variant of genetically-encoded green calcium sensor NTnC. 2017. Scientific Reports, подготовлена к печати.

64. Абрамчик Ю.А., Тимофеев В.И., Муравьева Т.И., Синицына Е.В., Есипов Р.С., Куранова И.П. Кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование рекомбинантной фосфорибозилпирофосфатсинтетазы из термофильного штамма Thermus Thermophilus НВ27 // Кристаллография. 2017. Т. 62. № 1. С. 73-76.

65. Синицына Е.В., Тимофеев В.И., Тузова Е.С., Костромина М.А., Муравьева Т.И., Есипов Р.С., Куранова И.П. Кристаллизация и предварительное рентгеновское исследование рекомбинантной аденинфосфорибозилтрансферазы из термофильного штамма бактерий Thermus Thermophilus НВ27 // Кристаллография. 2017. Т. 62. № 4. С. 595-598.

66. Mikhail V. Kovalchuk; Alexander E. Blagov; Yulia A. Dyakova; Andrey Yu. Gruzinov; Margarita A. Marchenkova; Georgy S. Peters; Yury V. Pisarevsky; Vladimir I. Timofeev and Vladimir V. Volkov Investigation of the Initial Crystallization Stage in Lysozyme Solutions by Small-Angle X-ray Scattering Crystal Growth & Design, 2016, 16 (4), pp 1792–1797.

67. Marchenkova M.A., Volkov V.V., Blagov A.E., Dyakova Y.A., Ilina K.B., Tereschenko E.Y., Timofeev V.I., Pisarevsky Y.V., Kovalchuk M.V. // In situ study of the state of lysozyme molecules at the very early stage of the crystallization process by small-angle X-ray scattering. // Crystallography Reports. 2016. Т. 61. № 1. С. 5-10.

68. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of recombinant ribokinase from Thermus Species 2.9., Yu. A. Abramchik, V. I. Timofeev, T. I. Muravieva, R. S. Esipov, I. P. Kuranova., Crystallography Reports, 2016, V. 61 I. 6 p. 974-978

69. Enhanced conformational flexibility of the histone-like (HU) protein from Mycoplasma gallisepticum. Altukhov DA, Talyzina AA, Agapova YK, Vlaskina AV, Korzhenevskiy DA, Bocharov EV, Rakitina TV, Timofeev VI, Popov VO. J Biomol Struct Dyn. 2016 Dec 29:1-9.

70. Samygina V.R. Inorganic pyrophosphatases: structural diversity serving the function. Russian Chemical Reviews, 2016, V.85, p464-474

71. Timofeev, V.I. ; Sinitsyna, E.V. ; Kostromina, M.A. ; Muravieva, T.I. ; Makarov, D.A. ; Mikheeva, O.O. ; Kuranova, I.P. ; Esipov, R.S. Crystal structure of recombinant phosphoribosyl-pyrophosphate synthetase 2 from Thermus thermophilus HB27 complexed with ADP and sulfate ions // Acta Crystallographica Section F-Structural Biology Communications (2017). V. 73, 369-375 DOI: 10.1107/S2053230X17007488

72. К.М.Бойко, В.О.Попов, М.В. Ковальчук. Увидеть - значит понять. От пространственной структуры к биологической функции. 2017. Вестник РФФИ, принята к печати.

73. Petrova, T. E., Boyko, K. M., Nikolaeva, A. Yu., Stekhanova, T. N., Gruzdev, E. V., Mardanov, A. V., Stroilov, V., Bezsudnova, E. Yu., Popov, V.O. Crystal Structure of Novel Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase GACE1337 from the Hyperthermophilic Archaeon Geoglobus acetivorans. Plos One. 2017. Submitted.

74. М.Г.Алексеева, Н.Н.Рудакова, Н.В.Захаревич, Д.А.Мавлетова, К.М.Бойко, А.Ю.Николаева, Д.А.Корженевский, В.Н.Даниленко. Новый ген аминогликозидфосфотрансферазы aph(3'')-id из streptomyces rimosus атсс10970, кодирующий устойчивость к стрептомицину // Генетика, 2017, принято в печать.

75. К. М. Бойко, А. Ю. Николаева, Г. С. Качалова, А. Н. Бончук, В. О. Попов. Jчистка, выделение, кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование btb-домена белка centrosomal protein 190 из drosophila melanogaster // Кристаллография, 2017, 62(6), 912-914, doi: 10.7868/S0023476117060054.

76. К. М. Бойко, А. Ю. Николаева, Г. С. Качалова, А. Н. Бончук, П. В. Дороватовский, В. О. Попов. Предварительные исследования BTB-домена белка lola из Drosophila Melanogaster методами малоуглового рентгеновского рассеяния и рентгеноструктурного анализа // Кристаллография, 2017, 62(6), 915-918, doi: 10.7868/S0023476117060066.

77. Е. Ю. Безсуднова, К. М. Бойко, В. О. Попов. Свойства трансаминаз разветвленных аминокислот в бактериях и археях // Успехи Биологической Химии, 2017, принято в печать.

78. D. D. Podshivalov, V. I. Timofeev, D. D. Sidorov-Biryukov, and I. P. Kuranova, “Virtual Screening of Selective Inhibitors of Phosphopantetheine Adenylyltransferase from Mycobacterium Tuberculosis”, Crystallography Reports, vol. 62, p. 405 (2017)

79. Anna G. Mikhailova, Tatiana V. Rakitina, Vladimir I. Timofeev, David M. Karlinsky, Dmitry A. Korzhenevskiy, Yulia К. Agapova, Anna V. Vlaskina, Marina V. Ovchinnikova, Valentina A. Gorlenko, Lev D. Rumsh, Activity modulation of the oligopeptidase B from Serratia proteamaculans by site-directed mutagenesis of amino acid residues surrounding catalytic triad histidine, In Biochimie, Volume 139, 2017, Pages 125-136.

80. V. Kh. Akparov V. I. Timofeev N. N. Maghsoudi I. P. Kuranova Three-dimensional structure of porcine pancreatic carboxypeptidase B with an acetate ion and two zinc atoms in the active site Crystallography Reports March 2017, Volume 62, Issue 2, pp 249–253

81. Valery Akparov, Vladimir Timofeev, Ilyas Khaliullin, Vytas Švedas & Inna Kuranova Structure of the carboxypeptidase B complex with N-sulfamoyl-L-phenylalanine – a transition state analog of non-specific substrate Pages 1-10 | Received 25 Jan 2017, Accepted 02 Mar 2017, Accepted author version posted online: 08 Mar 2017, Published online: 11 Apr 2017 http://dx.doi.org/10.1080/07391102.2017.1304242.

82. Дубова К.М., Соколов А.В., Костевич В.А., Грудина Н.А., Самыгина В.Р. Структуры фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, околоатомного разрешения. Кристаллография, 2017. Подготовлена к печати.

83. Соколов А.В., Дадинова Л.А., Петухов М.В., Буренков Г., Дубова К.М., Амарантов С.В., Волоков В.В., Васильев В.Б., Самыгина В.Р. Cтруктурные исследования комплекса фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, с церулоплазмином. Биохимия, 2017.

84. V.I. Timofeev, N.E. Zhukhlistova, Y.A. Abramchik, I.I. Fateev,M.A. Kostromina, T.I. Muravieva, R.S. Esipov, I.P. Kuranova. Crystalstructure of E. coli purine nucleoside phosphorylase with 7-deazahypoxanthine. Acta Crystallographica, Section F, 2018, v. 74, #6, pp. 355-362. DOI: 10.1107/S2053230X18006337.

85. V.I. Timofeev, N.E. Zhukhlistova, Y.A. Abramchik, T.I. Muravieva, R.S. Esipov, I.P. Kuranova. Crystal structure of Escherichia coli purine nucleoside phosphorylase complexed with acyclovir. Acta Crystallographica, Section F, 2018, v. 74, #7, pp. 402-409. DOI: 10.1107/S2053230X18008087.

86. V. Akparov, V. Timofeev, I. Khaliullin, V. Svedas, I. Kuranova. Structure of the carboxypeptidase B complex with N-sulfamoyl-L-phenylalanine – a transition state analog of non-specific substrate. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 2018, v. 36, #4, pp. 956-965. DOI: 10.1080/07391102.2017.1304242.

87. V.Kh. Akparov, V.I. Timofeev, I.G. Khaliullin, G.E. Konstantinova, I.P. Kuranova, T.V. Rakitina, V.K. Svedas. Mobile loop in the active site of Metallocarboxypeptidases as an underestimated determinant of substrate specificity. Biochemistry (Moscow), 2018.

88. К.М. Дубова, А.В. Соколов, Н.П. Горбунов, В.Р. Самыгина. Предварительные рентгеноструктурные исследования фактора, ингибирующего миграцию макрофагов, с околоатомным разрешением. Кристаллография, 2018, № 6.

89. Ekaterina Yu. Bezsudnova, Konstantin M. Boyko, Alena Yu. Nikolaeva, Yulia S. Zeifman, Dmitry A. Suplatov, Tatiana V. Rakitina and Vladimir O. Popov. Biochemical and structural insights into PLP fold type IV transaminase from Thermobaculum terrenum. Biochemie, 2018.

90. Ekaterina Yu. Bezsudnova, Tatiana N. Stekhanova, Alena Yu. Nikolaeva, Tatiana V. Rakitina, Anna V. Popinako, Konstantin M. Boyko and Vladimir O. Popov. Diaminopelargonic acid transaminase from Psychrobacter cryohalolentis is active towards (S)-(-)-1-phenylethylamine, aldehydes and α-diketones. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018.

91. Nina N. Sykilinda, Alena Y. Nikolaeva, Mikhail M. Shneider, Dmitry V. Mishkin, Artem A. Patutin, Vladimir O. Popov, Konstantin M. Boyko, Natalia L. Klyachko, Konstantin A. Miroshnikov. Structure of an Acinetobacter Broad-Range Prophage Endolysin Reveals a C-Terminal Cell Wall Binding alpha-Helix. Viruses, 2018.

92. Petrova T.E., Boyko K.M., Nikolaeva A.Yu., Stekhanova T.N., Gruzdev E.V., Mardanov A.V., Stroilov V., Bezsudnova E.Yu., Popov V.O. Structural characterization of geranylgeranyl pyrophosphate synthase GACE1337 from the hyperthermophilic archaeon Geoglobus acetivorans. Extremophiles, 2018.

93. Konstantin M. Boyko, Alena Y. Nikolaeva, Dmitry A. Korzhenevskiy, Maria G. Alekseeva, Dilara A. Mavletova, Natalia V. Zakharevich, Natalia N. Rudakova, Valery N. Danilenko, Vladimir O. Popov. Functional and structural characterization of novel aminoglycoside phosphotransferase Aph(3”)-Id from Streptomyces rimosus subsp. rimosus АТСС10970, a streptomycin inactivating enzyme possessing autophosphorylation function. JBC, 2018.

Последнее обновление: 07.06.2019
Задачи эксперимента:

• Получение высококачественных монокристаллов протеинов в модуле-1 КНА "Кристаллизатор" и возвращение их на Землю для рентгеноструктурного анализа в лабораторных условиях.

• Получение биокристаллических пленок из объемного раствора на подложках в модуле-3 КНА "Кристаллизатор" с использованием эффекта искусственной эпитаксии.

• Выращивание кристаллов биологических макромолекул методом встречной диффузии с использованием комплекта летной аппаратуры "JAXA PCG" и возвращение их на Землю для рентгеноструктурного анализа в лабораторных условиях.
Постановщики эксперимента: Куранова И.П., Любутин И.С.
Страна: Россия